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產(chǎn)品詳情
操作說明
注意事項
產(chǎn)品簡介
本產(chǎn)品是使用SYBR Green I嵌合熒光法進(jìn)行qPCR反應(yīng)的專用2×預(yù)混液。核心組分Taq DNA Polymerase是基于抗體法封閉的熱啟動DNA聚合酶，能有效抑制低溫條件下的非特異性擴(kuò)增，同時配以針對qPCR優(yōu)化的反應(yīng)Buffer，非常適合進(jìn)行高特異性、高靈敏度的qPCR反應(yīng)，可以在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)得到良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對靶基因定量準(zhǔn)確、重復(fù)性好、可信度高。同時本品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye，適用于所有qPCR儀器，無需在不同的儀器上調(diào)整ROX濃度。預(yù)混液中添加有藍(lán)色染料，具有加樣示蹤作用，同時配套提供黃色模板稀釋液，當(dāng)用黃色模板稀釋液稀釋模板，并將其加入到藍(lán)色反應(yīng)預(yù)混液中，顏色由藍(lán)色變?yōu)榫G色，能夠?qū)ε渲品磻?yīng)體系過程起到示蹤作用，防止漏加或錯加。該藍(lán)色與黃色染料的光譜與qPCR染料不重疊，不影響反應(yīng)結(jié)果。
儲存與運(yùn)輸
冰袋（wet ice）運(yùn)輸；-20℃避光保存，有效期12個月。
組成
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Component Number |
Component |
G3326-01 |
G3326-05 |
G3326-15 |
|
G3326-1 |
2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix |
1 mL |
5×1 mL |
15×1 mL |
|
G3326-2 |
40×Yellow Template Dilution Buffer |
1 mL |
1 mL |
1 mL |
|
說明書 |
1份 | |||
操作步驟
1. （可選）模板稀釋
本試劑盒中提供40×Yellow Template Dilution Buffer，即為40倍濃縮的黃色模板稀釋液，可用于模板稀釋，并通過液體顏色改變準(zhǔn)確判斷模板是否已經(jīng)加入到qPCR反應(yīng)液中。
以20 μL qPCR反應(yīng)體系為例，根據(jù)加入到20 μL qPCR反應(yīng)液中稀釋后的模板量，對應(yīng)原始模板稀釋方法可參考下表（以原始模板稀釋至100 μL為例）：
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稀釋后的模板 加入到20 μLqPCR反應(yīng)液中的體積(μL) |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
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100 μL模板稀釋體系中加入 40×Yellow Template Dilution Buffer的體積(μL) |
50 |
25 |
16.7 |
12.5 |
10 |
8.4 |
7.2 |
6.3 |
|
原始模板加入到 100 μL模板稀釋體系中的體積(μL) |
x |
x |
x |
x |
x |
x |
x |
x |
|
補(bǔ)加Nuclease-Free Water的體積(μL) |
50-x |
75-x |
83.3-x |
87.5-x |
90-x |
91.6-x |
92.8-x |
93.7-x |
例：若20 μL qPCR反應(yīng)體系中需加稀釋后模板2 μL。以100 μL模板稀釋體系為例，當(dāng)加入原始模板體積x為20 μL時，則需加入25 μL40×Yellow Template Dilution Buffer，再補(bǔ)加Nuclease-Free Water 55 μL至總體積為100 μL，此時稀釋后模板中40×Yellow Template Dilution Buffer即為10×。取2 μL此稀釋后的模板加入到20 μL反應(yīng)體系中，最終40×Yellow Template Dilution Buffer即為1×?？傊?，需保證在最終的qPCR體系中Yellow Template Dilution Buffer為1×。
注：如模板無需稀釋，或不使用G3326-2的模板稀釋液，可忽略此步驟。
2. 推薦qPCR反應(yīng)體系：
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Component |
20 μL rxn |
50 μL rxn |
Final Concentration |
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2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix |
10 μL |
25 μL |
1× |
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Forward Primer (10 μM)a |
0.4 μL |
1 μL |
0.2 μM |
|
Reverse Primer (10 μM)a |
0.4 μL |
1 μL |
0.2 μM |
|
Templateb |
Variable |
Variable |
as required |
|
Nuclease-Free Water |
Add to 20 μL |
Add to 50 μL |
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a.通常引物終濃度為0.2 μM可以得到較好擴(kuò)增效果。反應(yīng)性能較差時，可以在0.2-1.0 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度。
b.模板添加量因模板溶液中存在的靶基因的拷貝數(shù)不同而不同，進(jìn)行梯度稀釋研討適當(dāng)?shù)哪０逄砑恿?。?0 μL反應(yīng)體系中模板DNA添加量最好在100 ng以下。以RT-PCR反應(yīng)的cDNA（RT 反應(yīng)液）為模板時，添加量不要超過PCR反應(yīng)液總體積的10%。
3. PCR反應(yīng)程序（可根據(jù)機(jī)型適當(dāng)調(diào)整）：
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A. 兩步法 |
B. 三步法 | ||||||||
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階段 |
步驟 |
循環(huán)數(shù) |
溫度 |
時間 |
階段 |
步驟 |
循環(huán)數(shù) |
溫度 |
時間 |
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Stage 1 |
預(yù)變性 |
1 |
95℃ |
30 sec |
Stage 1 |
預(yù)變性 |
1 |
95℃ |
30 sec |
|
Stage 2 |
變性 |
40 |
95℃
|
15 sec |
Stage 2 |
變性 |
40 |
95℃ |
15 sec |
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退火/延伸 |
60℃ |
30 seca |
退火 |
55-65℃ |
10 sec |
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延伸 |
72℃ |
30 seca |
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Stage 3 |
熔解曲線 |
1 |
儀器默認(rèn)設(shè)置 |
Stage 3 |
熔解曲線 |
1 |
儀器默認(rèn)設(shè)置 |
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a：若需提高擴(kuò)增特異性，可使用兩步法程序或提高退火溫度；若需提高擴(kuò)增效率，可使用三步法程序或延長延伸時間。
注意事項
1. 如不需要進(jìn)行移液追蹤，則不使用40×Yellow Template Dilution Buffer進(jìn)行模板稀釋。
2. 試劑使用前請上下輕輕顛倒混勻，請勿渦旋振蕩混勻，避免產(chǎn)生氣泡。
3. 配制反應(yīng)液時，試劑請于冰上放置。
4. 本制品中含有熒光染料SYBR Green，配制PCR反應(yīng)液時應(yīng)避免強(qiáng)光照射。
5. 反應(yīng)液的配制、分裝請使用新的一次性槍頭，盡量避免樣品間的交叉污染。
6. 避免反復(fù)凍融Master Mix，解凍后后盡量在一個月內(nèi)使用完畢。
適配機(jī)型
ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900 HT Fast, StepOne?, StepOne Plus?, 7500/7500 Fast, ViiA 7?, QuantStudio? 系列, PikoRealTM Cycler;
Stratagene: Mx3000P?, 3005P?, 4000?;
Bio-Rad: CFX96?, CFX384?, iCycler iQ?, iQ5?, MyiQ?, MiniOpticon?, Opticon?, Opticon 2, Chromo4?;
Eppendorf: Realplex 2s, Mastercycler? ep, realplex;
IIIumina: Eco QPCR;
Cepheid: SmartCycler?;
Qiagen Corbett: Rotor-Gene? 系列;
Roche: LightCycler? 系列;
Takara: Thermal Cycler Dice系列;
Analytikjena: qTOWER系列;
qTOWER: LineGene系列。
引物設(shè)計原則
1. 擴(kuò)增產(chǎn)物長度建議控制在80-300 bp之間；
2. 引物長度：18-25 bp；
3. 引物中堿基G＋C含量應(yīng)在40%-60%之間；
4. 正向引物和反向引物的Tm值相差不超過2℃為佳，Tm值控制在58-62℃為佳；
5. 堿基分布的隨機(jī)性；
6. 引物最好不要含有自身互補(bǔ)序列，否則會形成發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)；
7. 兩個引物之間不應(yīng)有多于4個的互補(bǔ)或同源堿基，不然會形成引物二聚體，尤應(yīng)避免3'端的互補(bǔ)重疊；
8. 建議引物的3'末端堿基為G或C；
9. NCBI上的比對結(jié)果無其他非特異性產(chǎn)物出現(xiàn)。
常見問題及解決方法
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問題描述 |
可能原因 |
解決辦法 |
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反應(yīng)結(jié)束無擴(kuò)增曲線出現(xiàn)或者Ct值出現(xiàn)過晚 |
模板濃度過低 |
減少模板稀釋倍數(shù)重復(fù)實驗，樣品濃度未知的情況下先從最高濃度做起。 |
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模板降解 |
重新制備模板，重復(fù)實驗。 |
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體系中存在PCR抑制劑 |
一般為模板帶入，加大模板稀釋倍數(shù)或重新制備純度高的模板重復(fù)實驗。 |
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引物可能降解 |
長期未用的引物，應(yīng)先通過PAGE電泳檢測完整性，以排除其降解的可能。 |
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擴(kuò)增效率低 |
提高引物濃度，嘗試三步法擴(kuò)增程序，或者重新設(shè)計引物。 |
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擴(kuò)增產(chǎn)物過長 |
擴(kuò)增產(chǎn)物長度控制在80-300 bp。 |
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空白對照出現(xiàn)信號 |
反應(yīng)體系污染 |
首先更換空白對照的水，如果還發(fā)生同樣情況，繼續(xù)更換引物、吸頭、PCR管或啟用新的Master Mix； 反應(yīng)體系在超凈工作臺內(nèi)配制，減少氣溶膠污染。 |
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出現(xiàn)引物二聚體等非特異性擴(kuò)增 |
一般在35循環(huán)以后空白對照出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物屬正常情況，應(yīng)配合熔解曲線進(jìn)行分析； 重新設(shè)計引物，調(diào)整引物濃度或優(yōu)化PCR反應(yīng)程序。 |
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熔解曲線出現(xiàn)多峰 |
引物設(shè)計不佳 |
根據(jù)引物設(shè)計原則重新設(shè)計新引物。 |
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引物濃度過高 |
適當(dāng)降低引物濃度。 |
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cDNA模板存在基因組污染 |
提取后的RNA溶液使用DNA酶進(jìn)行消化，例如：dsDNase，以去除基因組污染，或設(shè)計跨內(nèi)含子引物。 |
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實驗重復(fù)性差 |
加樣誤差大 |
使用精準(zhǔn)的移液器、配合高品質(zhì)吸頭準(zhǔn)確移液； 高倍稀釋模板，加入大體積模板減少加樣誤差； 放大qPCR反應(yīng)體積。 |
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模板濃度過低 |
減少模板稀釋倍數(shù)重復(fù)實驗。 |
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qPCR儀不同位置的溫度偏差 |
定期校準(zhǔn)qPCR儀。 |
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擴(kuò)增曲線不光滑 |
熒光信號太弱，經(jīng)系統(tǒng)校正后產(chǎn)生 |
確保Master Mix中預(yù)混的染料未降解； 更換熒光信號收集更好的qPCR專用耗材。 |
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擴(kuò)增曲線斷裂或下滑 |
模板濃度較高，基線的終點(diǎn)值大于Ct值 |
減小基線終點(diǎn)(Ct值-3)，重新分析數(shù)據(jù)。 |
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個別孔擴(kuò)增曲線突然驟降 |
反應(yīng)管內(nèi)留有氣泡 |
確保Mix完全溶解，請勿渦旋振蕩混勻； 加樣完成后輕彈離心去除氣泡； 延長預(yù)變性時間至10 min，以去除氣泡。 |
凡合肥萬物生物科技有限公司銷售的產(chǎn)品均有嚴(yán)格的質(zhì)量保證。如發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品存在包裝規(guī)格疑問，請于收貨之日起七日內(nèi)向我公司總部或當(dāng)?shù)剞k事處提出，并請保證該產(chǎn)品，以備本公司進(jìn)行核對檢驗。如果發(fā)現(xiàn)有質(zhì)量問題，請于收貨后一月內(nèi)保留產(chǎn)品50%以上的量，以便本公司回收產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)檢，確認(rèn)產(chǎn)品質(zhì)量。如逾期，則視為已經(jīng)對本公司產(chǎn)品進(jìn)行驗收。 聲明：如發(fā)生產(chǎn)品索賠事宜，本公司僅在產(chǎn)品價格范圍內(nèi)酌情賠償，恕不接受超出產(chǎn)品價格范圍之賠償?？蛻粼谑褂眠^程中有任何技術(shù)問題可以撥打技術(shù)售后服務(wù)電話我們隨時給予解答。
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